旋转细胞培养与微重力效应模拟培养技术介绍
点击： 更新：2024-11-25 15:42:29 【打印】
【摘要】由美国宇航局空间实验室于20多年前首先研制的现代意义上的旋转生物反应器原本仅用于空间站实验，后来惊奇的发现该培养方式即使在地面实验室也可以模拟出微重力效应。后来该培养方式又用于将软骨细胞和聚合物可降解支架进行复合培养，获得直径7mm、厚度3mm的软骨片。模拟微重力培养有助于软骨化组织的生长，其中含有很多圆形细胞和糖胺聚糖及胶原等细胞外基质；用此方法培养的心肌组织含有许多梭形细胞，其收缩具有自律性和同步性。随后这种旋转生物反应器在美国被实验室广泛使用来模拟微重力效应培养并逐渐在国际上得到公认。
由美国宇航局（NASA）开发研制的旋转生物反应器是模拟微重力的细胞培养系统，其主体部分为一个沿对称轴自转的圆柱形细胞培养容器。该系统可以模拟实际的微重力场景下细胞的一些生物学特征，即微重力效应模拟，在旋转生物反应器中，平均引力向量是零向量，但是平均引力向量的幅度值是重力加速度值（g）。而在真实微重力条件下，平均向量和平均向量幅度值都是零。基于真实微重力和旋转生物反应器中所谓的微重力之间的差异。这种模型的准确性并不清楚，但其培养效果已经证明这并不影响该系统的应用。在2022年之前，这类旋转培养系统在我国本土实验室，几乎都是靠国外进口，然而随着我国空间站的建立，国内科研人员对于这种地面模拟微重力效应表现出了更多的兴趣，国内一些生物科技公司也深入此领域，这其中比较有代表性的如赛吉生物科技，他们在2022年于国内市场率先推出了SARC-G 通用全培养液旋转细胞培养系统，随后又率先推出了SARC-P 带培养液连续自动更新的全培养液旋转细胞培养系统。这为国内的科研人员提供了新的选择，也为国内实验室节约了进口设备的采购成本。此外，在产品功能上，也提供了更关键的参数设置，即模拟微重力效应水平设置，让使用人员能够直接按照预期的实验环境去设置，这一点非常友好。在正常生理情况下，细胞间是相互联系的，失去这种联系将会导致疾病，这对研究正常和病理组织以及器官的发生机制是很重要的。通常的二维细胞培养方法因重力的影响导致细胞间联系失常而使组织和器官不能正常生长，只能得到平的、极薄的培养产物。美国宇航局（NASA）生命中心首次研制并推出的组织、细胞三维高分化度的培养系统，其核心部分是旋转式细胞培养系统（RCCS，Rotary Cell Culture System, 国内产品称为SARC, Single Axis Rotary Culture,即单轴旋转培养系统）。该系统有圆柱状和圆盘状两种供细胞生长的培养容器，使用时需要将培养液完全充满整个容器，容器上配置有两个单通阀，可以通过该单通阀快速地将培养容器内部的气泡完全排除从而确保培养容器被100%充满培养液。整个细胞培养容器由电机驱动沿水平轴旋转，在这一特征上，国内产品SARC的称呼更为贴切，即Single Axis Rotary Culture。细胞及组织在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，从而中和了大部分的重力效应，使之处于微重力状态。培养液及细胞、组织随细胞培养容器一起旋转而不与细胞培养容器壁和其他部件相撞，使得细胞维持在连续的自由落体状态，以此来模拟细胞的微重力环境。
无论是在RCCS还是在SARC全培养液旋转细胞培养系统所建立的微重力模拟生长环境中，悬浮的细胞能以几乎接近正常的方式进行三维生长。由于系统无推进装置、气体或液体加压装置、气泡和搅拌器，使得整个生长环境的破坏性应力降低。旋转培养系统中的细胞、组织通过膜式气体交换器来吸入氧气和排出二氧化碳，足够大截面积的膜式气体交换能够确保培养容器内足够的氧气，比如SARC全培养液旋转培养系统的培养容器的气体交换膜面积与培养容器截面积几乎相当。通过培养容器上的单通阀可以消除所有气泡，以防其漩涡对细胞的生长带来不利影响。消除破坏性应力使生成的三维组织具有与父系相同的结构和功能。
其组织的培养密度为1010～1011细胞／ml；细胞的培养密度为108细胞／ml。与普通细胞培养装置相比有以下特点。
1、高分化度，旋转培养系统使具有高分化的人体组织能在实验室中生长，以便模拟感兴趣的器官和组织，如腺体和肿瘤。2、模拟微重力，要在体外模拟正常组织的微环境因细胞外基质太复杂和难适应环境而受阻，而细胞外基质对于调节细胞骨架和细胞核基质蛋白非常重要。旋转培养系统使分离原来在一起的细胞及细胞外基质成分的重力问题得到解决，模拟体内细胞所处的微重力状态。3、三维细胞培养，细胞培养装置因要保持细胞的悬浮需要产生剪切力，这将影响细胞间或细胞与基质间的稳定，使组织和细胞集中于自身的修复，大大影响了细胞生长和其他正常生理功能。发酵罐主要用于培养大量细菌，不适于大量培养人及其他哺乳动物组织细胞，因很难把大量的细胞移植到发酵罐中，即使能够培养，所得的细胞数也有限而且很难生成组织。而全培养旋转培养系统几乎可用于培养任何组织，而且可用于大规模生产，其细胞的成活率平均为97%而且分化度高。1.1 这类全培养液连续灌流旋转细胞培养系统的代表产品有传统的如美国NASA的RCMW,新生代的如国产科技公司赛吉生物SAGE BIO TECHNOLOGY的SARC-P。这类系统的基本结构由旋转细胞培养容器、控制器、驱动器和外围的管路部件（蠕动泵、多歧管、氧交换器和单通阀等）通过管道连接而成。氧气和二氧化碳交换是通过与外环相连的硅材料的交换器提供。蠕动泵用于保证培养液的注入和排出，以便得到更新。1.2 工作原理，该灌注式旋转细胞培养系统通过使整个细胞培养容器沿水平方向旋转来实现细胞培养容器中的细胞、组织在流体中悬浮的目的。在细胞培养容器中无气泡产生，这样使抑制细胞生长的剪切应力降低，所有的流体都通过蠕动泵来进行循环，以此来注入、抽取和灌注整个系统。通过开启葡萄糖或NaOH阀和把三通阀转向废液瓶，以此来注射葡萄糖溶液或NaOH溶液。通过关闭所有的输入阀并把三通阀转向循环系统，用于培养液的循环。悬浮细胞和贴壁细胞（其载体为固态可降解支架：微载体珠粒、胶原巨珠、藻朊珠粒或PGA可降解支架）都可在该细胞培养容器中能较好地生长。组织的移植物能较好地在培养液中进行培养或修复。灌注式旋转细胞培养系统是水平旋转的、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统。培养液、细胞和细胞团块在细胞培养容器内旋转，它们不与细胞培养容器壁或任何其他易致伤的物体相碰，使之处于微重力状态。因该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器，故几乎没有破坏性的剪切应力，使得大细胞团得以在模拟的微重力环境中形成。悬浮细胞和微载体珠粒上的贴壁细胞在水平的旋转式细胞培养细胞培养容器内产生一个均匀的、极低剪切力的液体悬浮轨道。随着细胞的长大，可调节旋转的速度来抵偿沉降速率。通用旋转细胞培养系统的概念首先是由赛吉生物科技提出来的，并应用在他们大的SARC系列旋转细胞培养系统上，为了与上面的培养液连续灌流系统相区分，以字母G即General 来代替，被称作SARC-G。与灌流旋转细胞培养系统相比，通用旋转细胞培养系统能够提供更多通道，比如常见的有2通道、4通道，甚至8通道或更多，用户在这类系统上可以同时完成多个样本的培养工作。与灌流旋转培养系统相比，通用性旋转细胞培养系统不能连续灌流培养液，因此无法自动更新培养液，用户需要根据细胞的生长周期定期人工更换培养液。3.1 2022年以前主要以美国NASA的RCCS （Rotary Cell Culture System）为代表并主导整个市场，产品主要有通用型旋转细胞培养系统和灌流型旋转细胞培养系统，用户可以参考已有文献通过对转速进行设置来达到需要模拟的微重力效应。
2022年以后，一些新的产品慢慢出现，这其中具有代表性的比如国内的赛吉生物科技SAGE-BIO的SARC(Single Axis Rotary Culture) 系统得到越来越多的实验人员的喜爱，该系统除了提供精确的转速设定外，另外提供了直接根据微重力水平输入参数，这极大地方便了科研人员。
全培养液旋转培养系统可用于培养几乎任何细胞、组织，而且其培养工艺可放大用于大规模生产，其细胞的成活率平均为97%且分化度高，可以通过采用大容量的旋转反应细胞培养容器用于人造肉的培养。同时，该系统还可以与支架、微球等进行联合培养，例如全培养液旋转细胞培养与可降解支架联合应用在组织工程。其一，可降解支架限定了构建的工程化组织的形状和空间结构，允许细胞在其中发生生长和分化，同时可降解支架降解与组织再生同步。其二，培养环境提供了有效的动态微环境，保证了空间均匀的细胞种植和同性的细胞增殖及组织再生。研究人员在搅拌条件下培养工程化软骨，发现软骨中细胞数和细胞外基质比静态培养方法多。实验表明，在模拟微重力的旋转生物反应器中培养，软骨中所含的糖胺聚糖最多。模拟微重力的细胞培养最早见于美国宇航局约翰逊空间中心。他们用此方法培养出直径达0.5～4mm的各种细胞聚集物和微载体细胞串珠。随后又将微重力细胞培养用于软骨细胞和聚合物可降解支架进行复合培养，获得直径7mm、厚度3mm的软骨片。由于模拟微重力细胞培养方法是通过调节旋转细胞培养容器的转动速度来满足培养物处于悬浮状态，因此提供了一种相对稳定的流体动力环境，以确保有效的营养和气体交换，同时，相对于其他动态培养方法具有较低的剪切应力。模拟微重力培养有助于软骨化组织的生长，其中含有很多圆形细胞和糖胺聚糖及胶原等细胞外基质；用此方法培养的心肌组织含有许多梭形细胞，其收缩具有自律性和同步性。这些培养的工程化组织可用于体内软骨移植及关节表面覆盖，也可用于体外研究缺氧、药物及微重力对心肌组织的影响。免责声明：部分内容参考相关文献和互联网，如涉及权利所属请联系我们删除。
上一条：《人源干细胞产品非临床研究技术指导原则》的通告（2024年第6号） 下一条：模拟变重力为水生、啮齿动物对重力变化的反应研究提供了新的解决方案
